Azoto apykaitoje dalyvaujančių bakterijų funkcinių genų įvairovė ir aktyvumas Chironomus plumosus lervose

Chironomus plumosus lervos yra dažnai randamas makrozoobentoso organizmas įvairaus tipo vandenyse, įskaitant ir Kuršių marias. Šios lervos, kaip ir kiti vandens bei sausumos organizmai, sudaro su mikroorganizmais gyvybiškai svarbias sąveikas, vadinamas simbioze. Ši sąveika padeda apsirūpinti maistinėmis medžiagomis, atlieka apsaugines funkcijas, be to, manoma, kad gali prisidėti ir prie vykstančių biogeocheminių procesų – azoto ciklo (Stief, 2013). Azoto ciklo procesas susideda iš kelių pagrindinių etapų - azoto fiksacijos, nitritų redukcijos bei amonio oksidacijos už kuriuos yra atsakingi įvairūs funkciniai genai. Todėl, norint įvertinti chironomidų lervose esančių bakterijų potencialą vykdyti azoto ciklo virsmus, buvo atliekama realaus laiko polimerazės grandininė reakcija, kurios metu, naudojant skirtingus funkcinius DNR žymenis, kiekybiškai įvertintas bakterijų potencialas vykdyti atskirus azoto ciklo proceso etapus. Vykdant polimerazės grandininę reakciją atliktas reakcijos protokolo optimizavimas kiekvienam funkciniam genui. Optimizavus protokolą ir norint kiekybiškai įvertinti bakterijų potencialą vykdyti azoto ciklo proceso etapus, buvo naudojama DNR, kuri nurodo tiriamo geno gausumą, bei kDNR, kurios metu apskaičiuojamas tiriamo geno aktyvumas. Taip pat, norint įvertint Chironomus plumosus lervos mikrobiomą, atlikta 16S rRNR V3 regiono amplifikacija ir sekvenavimas. Šiame darbe tirti 3 mėginiai, kurių kiekvieną sudarė 4 Chironomus plumosus lervos, surinktos Kuršių mariose. Naudoti 4 funkcinių genų žymenys – nifH, kuris atsakingas už azoto fiksaciją, nirS bei nrfA, kurie atsakingi už nitritų redukciją, bei amoA, kuris naudojamas amonio oksidacijoje. Atliktos kiekybinės analizės metu ir naudojant DNR, buvo nustatyta, kad Chironomus plumosus lervoje gali vykti azoto fiksacija bei nitritų redukcija, bet amonio oksidacija – ne. Apskaičiuotas skirtingų funkcinių genų gausumas 1 grame lervos naudojant nirS geną yra 321,65 × 106 ± 24,8 × 106, nifH geną 16,88 × 106 ± 0,45 × 106, o mažiausiai nrfA geną - 0,25 × 106 ± 0,09 × 106. Atlikus realaus laiko polimerazės grandininę reakciją naudojant kDNR, pastebėta, kad genų aktyvumas buvo ženkliai mažesnis nei gausumas - vidutinis nirS geno kopijų skaičius 1 grame lervos 38,82 × 106 ± 11,66 × 106, nifH geno 0,09 × 106 ± 0,03 × 106, o mažiausiai nrfA geno 0,05 × 106 ± 0,02 × 106. Atlikus lervoje esančio mikrobiomo 16s rRNR V3 regiono sekvenavimą buvo identifikuoti pagrindiniai bakterijų tipai - Firmicutes (38,02%), Bacteroidetes (23,93%), Proteobacteria (23,08%) bei Actinobacteria (12,31%). Nors ir nedideliais kiekiais, tačiau buvo identifikuotos bakterijų šeimos, kurios gali vykdyti ne tik azoto fiksaciją bei nitritų redukciją, tačiau ir amonio oksidaciją. Apibendrinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima teigti, kad atliekant kiekybinę funkcinių genų analizę realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu, svarbu optimizuoti reakcijos protokolą, atkreipiant dėmėsį į reakcijos specifiškumą ir efektyvumą, bei parinkti tinkamus mėginių skiedimus. Įvertinus Chironomus plumosus lervoje esantį mikrobiomą, buvo nustatyta, kad simbiontinės bakterijos turi potencialą vykdyti azoto ciklo procesus, tokius kaip azoto fiksaciją bei nitritų redukcija.

The larvae of Chironomus plumosus are widely found macrozoobenthos organisms in various types of waters, including Curonian Lagoon. These larvae, like other aquatic or terrestrial organisms, form vital interactions between microorganisms, called symbiosis. These interactions often contribute towards nutrients provision, perform protective functions, but nowadays it is thought that macrozoobenthos symbiotic organisms can take part in biogeochemical processes such as nitrogen cycling (Stief, 2013). It is known that nitrogen cycle process consists of few main stages - nitrogen fixation, nitrite reduction and ammonium oxidation, for which various functional genes are responsible. We hypothesized that symbiotic chironomid larvae bacteria can participate in these nitrogen cycle steps. Therefore, to assess the potential of bacteria in chironomid larvae to perform nitrogen transformations, a real-time polymerase chain reaction was performed. Performing quantative real-time polymerase chain reaction method and using different functional DNA markers it is possible to quantify bacteria potential to carry out individual steps in the nitrogen cycle. During polymerase chain reaction, optimization of reaction protocol was performed for each functional gene and the best conditions were used to quantify functional genes abundances and activity. Quantifying bacteria potential in nitrogen cycling was used DNA, which shows gene abundance, as well as cDNA, which shows test gene activity. Chironomus plumosus larvae microbiome evaluation was performed using universal prokaryotes primers. Chironomus plumosus larvae for this study were collected from central Baltic Sea part. Larvae microbiota potential to perform nitrogen cycling processes were examined with 4 functional genes: nifH, which is responsible for nitrogen fixation, nirS and nrfA, which are responsible for nitrite reduction and amoA, which is crucial for ammonium oxidation. During real-time polymerase chain reaction protocol optimization have been identified the most appropriate primers hybridization temperatures, multiplication cycles duration and suitable samples dilutions. Attention was paid to the efficiency (>80%) and specificity of the reaction. Quantitative analysis using DNA revealed that nitrogen fixation, nitrite reduction can take place in chironomid larvae. In 1 gram of larva nirS gene copy numbers was 321,65 × 106 ± 24,8 × 106, nifH gene 16,88 × 106 ± 0,45 × 106 and nrfA gene - 0,25 × 106 ± 0,09 × 106. Ammonia oxidation potential was not found. Quantative analysis using cDNA showed that genes activity was significantly lower than the abundance. Average number of copies per gram of larva using nirS gene were 38,82 × 106 ± 11,66 × 106, nifH gene 0,09 × 106 ± 0,03 × 106, nrfA gene 0,05 × 106 ± 0,02 × 106. AmoA gene activity, as well as abundance, were not detected. Sequencing of the 16s rRNA V3 region of larval microbiome revealed that larva gut is extremely densely inhabited by bacteria from 4 phyla, Firmicutes (38,02%), Bacteroidetes (23,93%), Proteobacteria (23,08%) and Actinobacteria (12,31%). Although in small quantities bacterial families and genera have been found that can perform not only nitrogen fixation and nitrite reduction, but also ammonium oxidation. Summarazing results obtained in the study, it can be stated that when performing quantitative analysis of functional genes by real time polymerase chain reaction method, it is important to optimize reaction protocol by paying attention to the specificy and efficiency of reaction, to choose suitable primers hybridization temperature and to use appropriate sample dilutions. Evaluation of Chironomus plumosus larvae microbiome revealed that symbiotic bacteria have potential to perform different nitrogen cycle pathways such as nitrogen fixation and nitrite reduction.